Digestão tripsínica em solução

(Kinter, M. and Sherman, NE. Protein sequencing and identification using tandem mass spectrometry. Wiley, 2000. Pp162-163)

Reagentes

Todos os reagentes devem ser preparados no momento do uso. É preferível utilizar água MilliQ ou de qualidade similar. Todos os reagentes devem ser de grau analítico. É recomendável utilizar tripsina Mass Spectrometry grade, pois estas apresentam modificações em seus resíduos de lisina (metilações) que minimizam a autólise, contribuindo para minimizar fragmentos de tripsina na solução do analito. Os reagentes devem ser preparados em frascos de vidro.

1. Solução estoque – Tris: dissolver 12,1 g de Tris base em 200 mL de água. Ajustar o pH da solução para 7,8 com HCl 6M. Adicionar água para um volume final de 250 mL. A concentração final do Tris será de 0,4M. Esta solução pode ser guardada em geladeira (4ºC) por 30 dias.

1. Uréia 6M em Tris 100 mM: Pesar 2 g de uréia em um frasco de 15 mL. Adicionar 1,25 mL da solução estoque de Tris e ajustar o volume para 5 mL com água. A concentração final será 6M de uréia e 100 mM de Tris.

1. Agente redutor: dissolver 30 mg de ditiotreitol (DTT) em 750 μL de água. Adicionar 250 μL da solução estoque de Tris e agitar para completa dissolução. A concentração final de DTT será 200 mM e 100 mM de Tris.

1. Agente alquilante: Dissolver 36 mg de Iodoacetamida (IAA) em 750 μL de água. Adicionar 250 μL da solução estoque de Tris e agitar para completa dissolução. A concentração final de IAA será 200 mM e 100 mM de Tris.

1. Solução de tripsina: Adicionar 25 μL de solução estoque de Tris (em banho de gelo) e 75 μL de água gelada a 20 μg de tripsina (Mass Spec. grade). Dissolver a tripsina por aspiração com pipeta. A concentração final de tripsina será 200 ng/μL. A solução deverá ser mantida no gelo até o momento do uso. (OBS: à exceção das demais soluções esta deverá ser preparada APENAS no momento do uso).

Tubos de amostra: podem ser utilizados tubos de 1,5 mL de plástico. Tubos siliconizados podem ser utilizados, porém devido ao alto teor protéico da amostra, não são estritamente necessários. Lavar os tubos com etanol absoluto, seguido por água e secá-los antes do uso. Se utilizar tubos da marca Axygen, não é necessário lavar os tubos.

Primeiro dia

A amostra de proteína deve ser previamente seca e ressuspendida no tampão 2.

1. Aliquotar 100 μL de amostra (contendo 100 -1000 ug de proteína total) em eppendorf de 1,5 mL.
2. Adicionar 5 μL da solução 3 (agente redutor) e vortexar gentilmente.
3. Incubar por 2 h a temperatura ambiente.
4. Adicionar 20 μL da solução 4 (agente alquilante) e vortexar gentilmente.
5. Incubar por 1 h a temperatura ambiente.
6. Adicionar 20 μL da solução 3 para consumir a iodoacetamida que não reagiu na etapa 4. Vortexar gentilmente e incubar por mais 1 h a temperatura ambiente.
7. Reduzir a concentração de uréia diluindo a mistura com 775 μL de água. Vortexar. A concentração de uréia irá ser reduzida p/ ~0.6M, concentração que a tripsina se mantém ativa.
8. Adicionar  tripsina (A proporção protease:substrato deverá ser 1:50 (m:m).  Vortexar e incubar a 37°C overnight.

Segundo dia

Interromper a reação ajustando o pH da solução para um valor menor do que 6 (usar fitas de pH) com ácido acético concentrado.

Secar a solução em liofilizador ou speed vac.

Retirar os sais  e uréia utilizando Sep-Pack  C18 (Waters).

Secar a amostra em liofilizador ou speed vac.

Ressuspender em ácido fórmico 0.1%.