digestão em gel
digestão em gel

Digestão In gel

 (Hanna, SL ET al., 2000. Microbiology 146:2495-2508,200- com algumas modificações)

 

 

Inicialmente todos os tubos que serão utilizados deverão ser lavados da seguinte forma :

 

  • 1X etanol 96% (ou absoluto)
  • 1X água MilliQ
  • 1X etanol 96% (ou absoluto)

 

Colocar os tubos em estufa para secar.

 

 

1.      Reagentes (todos devem ser preparados NO DIA do uso)

(As soluções 1 a 4 devem ser preparadas em frascos de vidro)

 

Soluções suficientes para 25 amostras (com folga)

 

  1. Destain (remover o SDS): metanol 50% /ácido acético 5% em água milliQ.
  2. Bicarbonato de amônio 100 mM: 100 mM de bicarbonato de amônio em água MilliQ (PM=79.06; 158mg em 20 mL de água MilliQ).
  1. Acetonitrila (100%)
  2. Ditiotreitol (DTT) 10 mM: 1.5 mg de DTT em 1mL de bicarbonato de amônio 100mM
  3. Iodoacetamida (IAA) 50mM: 9 mg de IAA em 1mL de bicarbonato de amônio 100mM. ESCURO
  4. Solução de Tripsina (em gelo): 20ng/ml (Promega, sequence grade, cat.number V511, 20 mg ) em bicarbonato de amônio 50mM

ou

Preparo da tripsina: 100mg de tripsina (SIGMA, Sequencing grade) em 2000mL de bicarbonato de amônio 50 mM gelado (manter a solução em banho de gelo). Concentração final da tripsina 50ng/mL. (se for estocar a tripsina em -20C, prepará-la em HCl 1mM, pH ~3,0)

  1. Solução de extração 1: acido fórmico 5% (em água MilliQ)
  2. Solução de extração 2: acido fórmico 5% em acetonitrila 50%

 

  1. 2.   Procedimento

 

Observar com atenção os pedaços de gel, certificando-se de que eles não ficaram presos na ponta da ponteira e foram colocados (por descuido) no tubo de extração. Dar um “spin” rápido garante que os pedaços fiquem no fundo dos tubos após cada etapa deste processo de digestão in gel. É possível utilizar a mesma ponteira para todas as amostras durante o desenvolvimento de uma mesma etapa (descoloração, lavagem, alquilação, redução,etc), uma vez que (pelo fato de os peptídeos ainda estarem fixos na matriz de poliacrilamida-gel) não há risco de contaminação cruzada. As ponteiras só deverão ser trocadas entre os diferentes processos (redução, alquilação, etc). Na etapa de extração, a mesma ponteira (uma por amostra) é usada para os todos os passos.

 

Dia 1

 

  1. Cortar as bandas do gel (tentar cortar pedaços de 1mm).
  2. Descoloração das bandas: adicionar 0.5 mL da solução 1 (destain). Incubação por 40 min à temperatura ambiente. (Pode agitar em vortex +/- 15 min até perder o Max do azul do Coomasie)
  3. Remover esta solução e adicionar mais 0.5mL da solução 1 (destain) Incubação por 40 min à temperatura ambiente . (Pode agitar em vortex +/- 15 min até perder o Max do azul do Coomasie)
  4. Desidratação: remover a solução de destain (descartar) e desidratar o gel adicionando 200mL de acetonitrila (100%). Deixar nesta solução por 5 minutos. Remover a acetonitrila e repetir este passo.
  5. Evaporar o que restou de acetonitrila em Speed Vac  (2 a 3 minutos).
  6. 6.    Redução: adicionar 30mL* da solução de DTT 10 mM. Incubar por 30 minutos à temperatura ambiente. (* ou até que o gel esteja 100% em solução – se alterar o volume, fazer os passos 7,8,10 proporcionais ao volume adicionado)
  7. 7.    Dar um spin rápido e remover a solução de DTT.
  8. 8.    Alquilação: adicionar 30mL da solução de IAA 50mM. Incubar por 30 minutos à temperatura ambiente. ESCURO
  9. 9.    Dar um spin rápido e remover a solução de IAA.

10.  Lavar o gel com 100mL de bicarbonato de amônio 100 mM por 10 minutos e, em seguida, remover esta solução.

11.  Desidratar o gel com 200mL de acetonitrila (100%), incubando por 5 minutos a temperatura ambiente. Remover a acetonitrila.

12.  Rehidratação: rehidratar o gel com 200mL de bicarbonato de amônio 100 mM por 10 minutos.

13.  Dar um spin rápido e remover a solução de bicarbonato de amônio.

14.  Desidratar o gel com 200mL de acetonitrila (100%), incubando por 5 minutos a temperatura ambiente. Remover a acetonitrila. Repetir este passo.

15.  Evaporar o que restou de acetonitrila em Speed Vac (2 a 3 minutos, alternativamente pode-se usar um liofilizador por ~5min.).

16.  Preparo da tripsina: 100mg de tripsina (SIGMA, Sequencing grade) em 2000mL de bicarbonato de amônio 50 mM gelado (manter a solução em banho de gelo). Concentração final da tripsina 50ng/mL. (se for estocar a tripsina em -20C, prepará-la em HCl 1mM, pH ~3,0)

17.  Adicionar 16mL (800ng de tripsina) da solução de tripsina para cobrir o gel e reidrata-los por 30 minutos em banho de gelo.

18.  Dar um spin rápido, remover o excesso de solução de tripsina e adicionar 5 a 20mL de  bicarbonato de amônio 50 mM (diluir 2x a solução de bicarbonato de amônio 100mM) ou até que os pedaços de gel sejam cobertos por solução. Deixar overnight a 37 C.

 

Dia 2

 

(não remover a solução de bicarbonato de amônio do dia anterior)

 

  1. 19.   Extração : adicionar 10mL da solução  #1 de extração (poderá ser adicionado 30mL caso o pedaço de gel seja grande). Incubar por 10 minutos a temperatura ambiente, dar um spin rápido e despejar o sobrenadante num eppendorf de 500  ml separado (previamente lavado).

 

 20. Adicionar 12 mL da solução  #2 de extração. Incubar por 10 minutos a temperatura ambiente, dar um spin rápido e coletar o sobrenadante no tubo que fora previamente separado (e já contem o extrato do passo anterior). Repetir este passo.

 

21. Evaporar a amostra Speed Vac (~40 minutos) de forma a restar aproximadamente  1 mL (tentar não evaporar totalmente a amostra). è Zip-Tip

 

 

LC-MS/MS

 

1. Ressuspender a amostra em  15 mL de acido acético 3% (ou ácido fórmico 0,1%) para analise por LC-ESI-MS (MS/MS). Guardar as amostras a –20 C.

 

 2. Para a analise, pode ser aplicado volumes de 0.1 a 10mL  de solução em uma coluna (75 mm x 7.5 cm) C-18.



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